非洲猪瘟的起源
1909年，在肯尼亚的欧洲家猪中，非洲猪瘟被首次发现，此后撒哈拉以南的绝大部分国家都有ASF疫情报道。在东部非洲，ASF的主要传播模式是疣猪和蜱的传播循环，分离的ASFV包含22个不同的基因型。而在西部非洲，猪猪传播模式发挥主要作用。目前，ASF仍在27个非洲国家流行。
非洲猪瘟传入俄罗斯后，令俄罗斯养殖业遭受了巨大的损失。截至目前，俄罗斯已经捕杀两百多万头感染非洲瘟疫的病猪，直接经济损失超20亿卢布，间接经济损失达到300亿卢布。
2011年，俄罗斯再次爆发两起非洲猪瘟疫情。2011年10月20日，世界动物卫生组织“OIE”接到俄罗斯报告，称在克拉斯诺达尔州Krasnodar Krai地区新发两起非洲猪瘟疫情，其中10月11日始于位于Slavyansky的Delma公司，6049头猪中的14头母猪被感染。另一起发生在位于Starominskynd 地区的Starominskoe公司，2183头猪中的96头表现出症状，其中8头死亡，2175头被销毁。
就非洲猪瘟疫情可能向亚洲东部地区蔓延的趋势，俄罗斯方面曾多次向中国发出过警告。
2016年10月，俄罗斯农业部长亚历山大·特卡乔夫曾在一个会议上称，非洲猪瘟可能会传播到中国。特卡乔夫说：“在俄罗斯有2500万头猪，在中国有4.3亿头，这样的养殖密度迟早猪瘟会被带过去。就像曾经这个病毒就是通过野猪经格鲁吉亚被带进俄罗斯一样”。（备注：2018年1月统计显示中国的生猪存栏量为4亿头，国内每年生猪出栏量为7亿头左右。）
2017年3月初，乌克兰爆发非洲猪瘟疫情之后，俄罗斯也宣布在位于西伯利亚地区伊尔库茨克州发现非洲猪瘟疫情。
2017年3月31日俄罗斯联邦兽医及动植物卫生监督局副局长尼古拉·弗拉索夫表示，伊尔库茨克州爆发非洲猪瘟将对中国的生猪养殖业构成威胁。 弗拉索夫在该局局务会议上表示：“非洲猪瘟将不仅蔓延到西伯利亚地区，这种传染病还会传入中国”。
2017年9月，中国原农业部曾下发关于印发《非洲猪瘟疫情应急预案》的通知，要求各地在发现非洲猪瘟疫情时，按照属地管理、分级响应的原则做出应急响应；按程序启动《国家突发重大动物疫情应急预案》和《非洲猪瘟疫情应急预案》，并根据疫情形势和风险分析结果及时调整响应级别。
2018年8月1日，辽宁沈阳地区发现疑似非洲猪瘟疫情，目前疫区内913头生猪已经全部扑杀。8月3日，经中国动物卫生与流行病学中心（国家外来动物疫病研究中心）确诊，该起疫情为非洲猪瘟疫情；当天，农村农业部发布了非洲猪瘟 Ⅱ级 疫情预警。
非洲猪瘟流行的27个非洲国家
最常见的一种艾滋病毒起源于上个世纪二十年代非洲中部的刚果共和国首都金沙萨。当时金沙萨属于比利时殖民地，名称为利奥波德维尔（Leopoldville），很多年轻人到那里淘金。
这个殖民地成为首都后，很快有了铁路，因此方便了人口流动，同时性乱现象也多了起来。
报导说，人口流动增多，固定人口也增多，生活条件提高，交通更加发达，性乱带来的感染病也多起来。
又一个恶魔： 非洲猪瘟
非洲猪瘟的威力非洲猪瘟，顾名思义，是人们最早在非洲发现的一种危害养猪业的烈性传染病。虽然叫猪瘟，但是跟传统猪瘟完全不一样，在微生物学上有单独的种属。它于1921年首次出现于非洲的肯尼亚。这种病由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起，可通过航班或港口废弃物、猪肉及其制品、野猪携带病毒和软蜱携带病毒等方式传播。
这是一种超级神奇（可怕的）病毒，ASFV 是 由节肢动物传播的唯一 DNA病 毒 。完整 的 ASFV病毒 粒子较 大 ，直径约 200 nm，自内而外由核蛋 白体 (nucleoid)、 核心 (core shel1)、内囊膜 (inner envelope)、衣 壳 (capsid)、外 囊膜 (outer envelope)构成 。外囊膜为双层脂质囊膜，在病毒 出芽 时来 自于宿 主 细 胞 的细 胞 膜 。衣 壳 呈 二 十 面体 对 称 ，有 大 约2000个壳粒组成。
这种病毒非常恐怖，超强的耐受力，超强的传染能力，超强的致死率，没有商用的疫苗。这种病毒对外界环境抵抗力很强 ，能耐 受相 当宽 的 pH (pH4～13)。在血 液 、粪 便和组织中存活时间长达半年 。在感 染的生的或 者未完全煮熟的猪肉制品中存活时间长达 3个 月，在冻肉中可存活数年 。家猪感染后，急性的ASF致死率最高的达100%。
中国科学家正在攻克
非洲猪瘟（Africanswine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，发病率高，死亡率可高达100%，一经确诊必须全部扑杀。世界动物卫生组织（Office international desépizooties，OIE）将ASF列为必须报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，是重点防控的外来病。2018年8月3日，中国辽宁省沈阳市确诊国内首例非洲猪瘟疫情，疫点内913头生猪已经全部扑杀和无害化，消毒工作全面展开。虽然国内在此之前无非洲猪瘟疫病例报告，但相关防控以及疫苗研制工作一直在推进。研究人员在免疫佐剂、弱毒疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗（P72、P30、P54、P12）方面已进行了大量的工作，但遗憾的是，临床试验结果显示这些疫苗均不能提供良好的保护效率。近期研究发现通过建立非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9基因敲除操作技术平台，将为非洲猪瘟病毒基因功能研究和毒力基因缺失的新型弱毒疫苗研究提供便捷的工具。
传统ASFV疫苗研究进展
目前国内外已经研制出ASFV的灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、同源重组弱毒疫苗以及其他新型疫苗，但这几种疫苗都存在不同程度的局限性。
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灭活疫苗
灭活疫苗是最经典最早期的疫苗研制方式。非洲猪瘟病毒刚被发现时，研究人员就已开始研制灭活疫苗。然而，至今为止，使用或不使用佐剂都不能诱导机体产生有效保护性反应，经加热、复方碘溶液、甲苯、福尔马林、结晶紫、β-丙内酯、乙酰氮丙啶和缩水甘油醛处理的ASFV灭活疫苗虽部分能刺激猪产生抗体，但即使借助佐剂仍无法抵御ASFV的攻击。
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亚单位疫苗
亚单位疫苗的研究策略主要是将具有中和表位的ASFV保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，然后将产生的蛋白质或多肽递呈给抗原递呈细胞，以诱导产生高滴度的抗ASFV中和抗体。ASFV编码的结构蛋白有很多。恢复期猪血清显示P72、P30和P54为感染过程中引起体液免疫应答最重要的３个抗原蛋白。针对P72和P54的抗体可以阻止病毒吸附，针对P30的抗体可以阻止病毒内吞。但目前大量研究结果显示，将这3个蛋白质作为ASF亚单位疫苗仅可提供部分保护或没有保护。
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DNA疫苗
DNA疫苗又称核酸疫苗。作为新一代的疫苗研制方向，ASFV的相关研究工作也已经在开展。Argilaguet等利用真核表达质粒pCMV-PQ表达P30和P54，结果显示，该DNA疫苗免疫猪后无法抵御强毒株的攻击。随后，该实验室又进一步将ASFV血凝素蛋白基因和泛素基因（ubiquitin）连入上述DNA疫苗中，结果仍不能达到完全保护的功效。
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同源重组弱毒疫苗
弱毒疫苗通常能赋予机体针对同源病毒的相对保护力，但针对异源病毒的保护力弱甚至没有保护力，同时弱毒疫苗还存在造成潜伏感染和毒力返强的可能性。对于弱毒疫苗的研制，同源重组一直是ASFV基因缺失的主导技术。但该方法的同源效率非常低，且需要经过多轮纯化才能去除野生型病毒。目前科学家们已利用同源重组技术成功构建了多种基因敲除的ASFV。重组致弱疫苗不仅可以提供良好的免疫保护，而且由于复制缺陷的特点，将显著降低疫苗毒株返强和毒副作用。然而，这类疫苗的动物实验仍停留在实验室阶段，由于大部分单一基因缺失毒株的毒力仍难以稳定致弱，至今很难应用于临床免疫防控。
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由于ASFV的病毒DNA两端存在可变区，基因组DNA末端交叉连接成环形，病毒粒子含依赖于DNA的RNA多聚酶，而该聚合酶的亚基种类至今尚未全面了解。因此，至今难以在该病毒中使用细菌染色体组技术。
CRISPR/Cas9敲除技术在ASFV疫苗研究中的应用
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CRISPR/Cas9敲除技术
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自化脓链球菌的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motifs, PAM）结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单（5'-NGG-3'），几乎可以在所有基因中找到大量靶点。迄今为止，CRISPR/Cas9系统已广泛用于动、植物和微生物的基因组改造。科研人员已经使用CRISPR系统编辑了多种病毒，例如I型单纯疱疹病毒，Epstein-Barr病毒，伪狂犬病毒和牛痘病毒等。2018年，CRISPR/Cas9系统已开始用于非洲猪瘟病毒的基因组改造，且敲除效率得到显著提升。
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CRISPR可以高效构建重组ASFV并易于重组病毒的纯化
ASFV对稳定细胞系适应后，会引起病毒基因组的大部分区域自发缺失，导致病毒毒力严重致弱，丧失对同源亲本毒株攻击的保护能力。因此，为了保持病毒基因组的稳定性，必须在猪巨噬细胞的原代细胞培养物中产生重组ASFV。重组ASFV的构建通常依靠通过靶向基因的两侧向ASFV导入含有同源重组臂的质粒，并用质粒中的报告基因取代靶向基因。这种同源重组方法，尤其是在猪巨噬细胞培养中进行的同源重组方案，重组效率非常低，野生病毒背景高，难以纯化重组ASFV，需要进行多轮空斑纯化或有限稀释。
2018年，Borca等采用CRISPR/Cas9诱导Cas9双链断裂ASFV基因组中8-DR的开放阅读框（open reading flame, ORF），在猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages, PAM）中从Georgia07毒株的基因组中删除非必需基因8-DR，并用红色荧光蛋白（red fluorecent protein, RFP）基因替代。敲入质粒中包含左臂8-DR ORF上游区域（72 169bp~73 369bp）和右臂8-DR ORF的下游区域（74 454bp~75 653bp），插入片段为RFP和Blasticidin基因（图1）。设计相关gRNAs，克隆入pCAS-Guide载体（来自Blue Heron Biotech公司）中。随后，在感染野生病毒的PAM细胞中，将两种8DR靶向gRNAs载体与敲入载体共转染，使用CRISPR/Cas9系统后，在转染后24 h，检测到约4log10 TCID50的重组ASFV。而对比传统的同源重组技术，获得的重组病毒低于滴定检测限（<0.5Log10TCID50），但通过细胞盲传，可以检测到荧光表达，获得重组病毒。这些结果表明使用CRISPR/Cas9比传统的同源重组技术的重组效率明显提升。该方法有效地构建ASFV重组病毒，通过对比试验发现，该技术相对于同源重组方法，能够显著提高重组ASFV，并易于重组病毒的纯化。结果表明，使用CRISPR技术编辑ASFV基因组已经成为了可能。
图1 ASFV重组位点设计
Fig. 1 ASFVrecombination site design
采用有限稀释法对CRISPR/Cas9敲除的ASFV Georgia病毒进行纯化，利用感染后荧光细胞来监测纯化，结果发现，使用CRISPR/Cas9系统明显增加重组病毒重组效率，比使用传统同源重组方法的纯化过程更容易，仅经过5次有限稀释，即可获得纯化子，这比使用传统的同源重组方法纯化ASFV所需的时间缩短很多。
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X330-ΔNLS1/2neoR载体构建以及稳定表达gRNA野猪肺细胞系建立
X330-ΔNLS1/2neoR载体构建为了鉴定和克隆ASFV基因组中合适的CRISPR/Cas9靶序列，需要构建合适的载体。有研究人员使用载体质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas920。该载体质粒最初被设计用于编辑哺乳动物基因组，在Cas9 ORF的两端编码核定位信号（nuclear localization signal, NLS）。由于ASFV主要在受感染细胞的细胞质中复制，因此需去除Cas9的NLS。在去除两端的NLS之后，插入新霉素抗性基因，从而构建获得pX330-ΔNLS1/2neoR载体。而NLS-less Cas9载体已被成功应用于痘苗病毒的定向突变。
稳定表达gRNA的野猪肺细胞系（wild boar lung cell line, WSL）建立靶向P72和核酸酶的gRNA序列插入至pX330-ΔNLS1/2neoR载体中，将质粒分别转染野猪肺细胞系（WSL），新霉素抗性筛选细胞，通过Western blot、PCR和基因组DNA测序检测Cas9表达。结果表明，特异性gRNA在多次（>50）传代中稳定表达，且未发生Cas9核酸酶的脱靶反应。在该细胞系中，ASFV复制明显受到抑制。CRISPR/Cas9系统还有助于从病毒基因组中特异性地删除CP204L（P30）和其他必需的或非必需的ASFV基因。必需基因敲除时，为了避免病毒不能复制，可以通过共转染基因表达质粒的互补实验来姆弥补。该策略不仅有助于阐明病毒基因功能，也适合作为减毒或单循环活疫苗。非洲猪瘟基因缺失活疫苗提供了新的研究思路，更多ASFV基因的敲除研究工作正在进行之中。
2018年8月3日，中国辽宁省沈阳市确诊国内首例非洲猪瘟疫情。8月16日河南省郑州市经济开发区某食品公司屠宰场发生一起生猪非洲猪瘟疫情。8月19日，江苏省连云港市海州区发生一起生猪非洲猪瘟疫情。每起疫情一经确诊，应急响应机制立即被启动，通过采取封锁、扑杀、无害化处理、消毒等处置措施，禁止所有生猪及易感动物和产品运入或流出封锁区，疫情均已得到有效控制。疫情的不断发生说明非洲猪瘟的基础致病性研究和储备性疫苗的研究工作已经迫在眉睫。而CRISPR也许就是打开ASFV疫苗研制这扇门的一把钥匙，CRISPR技术的应用为非洲猪瘟病毒的基础致病性研究带来了曙光，也为研制非洲猪瘟基因缺失活疫苗提供了新的研究思路，更多ASFV基因的敲除研究工作正在进行之中。